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用基因“拼图”!欧洲首次人工合成活的新冠病

反向遗传学是一种弗成或缺的对象,它彻底改变了对病毒发病机制和疫苗开拓的熟识。

今朝,人们已经能够做到使用基因工程对自然界所存在的病毒进行必然程度的改造,使病毒能够为人所用,以致“以毒攻毒”,为人类医疗做供献。

例如,去年清华大年夜学的钻研团队就在《自然》颁发了一篇论文,是将自然界存在的一些致病力较弱的病毒基因改造后制成特殊的溶瘤病毒,能够选择性地感染肿瘤细胞,在其内大年夜量复制并终极摧毁肿瘤细胞。

但从头开始“重修”病毒则是另一个问题。

2002年,美国纽约州立大年夜学石溪分校的科学家仅使用邮购的基因组序列信息和原材料、以及从网高低载的配方,首次在试管中合成出了小儿麻痹症病毒。

因为RNA相对不敷稳定,钻研职员使用一些邮购的质料合成出DNA分子后,又用一种酶将其转录成小儿麻痹症病毒的RNA。当这些RNA被放入装有特定化合物和酶的试管中后,它们开始自行复制,终极形成大年夜量病毒。

不过,脊髓灰质炎病毒为20~30纳米大年夜小的小核糖核酸病毒,而冠状病毒则在病毒中属于“大年夜块头”(新冠病毒的大年夜小约为125纳米)。以是,人工重组新冠病毒会加倍艰苦。这类大年夜型RNA病毒基因组在大年夜肠杆菌中克隆和操作起来很麻烦,它们体积宏大年夜,而且有时会呈现不稳定性。

近日,颁发在《自然》上的一篇论文“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”展示了一个基于酵母菌的合成基因组学平台的完备功能,它可以从基因上重修多种RNA病毒,包括冠状病毒科、黄病毒科和副黏病毒科的成员。

黄病毒属病毒粒子直径约为40-50nm,副黏病毒则平日直径150nm-350nm,也属于大年夜型病毒。这一钻研注解,该平台也有望用于寨卡病毒、仙台病毒、腮腺炎病毒、黄热病毒等的人工合成。

论文通讯作者为瑞士伯尔尼大年夜学病毒学与免疫学钻研所的Volker Thiel以及该校兽医学院熏染病与病理生物学学系的Joerg Jores。此前该论文已颁发在预印本网站BioRxiv上。

详细而言,钻研团队将病毒基因组分成12个片段,大年夜小在0.5kbp-3.4kbp。为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪,钻研团队又在此中插入了表达GFP(绿色荧光蛋白)的片段,共计14个片段,交由试剂公司在大年夜肠杆菌中化学克隆合成。

钻研团队使用转化偶联重组技巧 (TAR),用酵母菌的同源重组系统依据末尾重复的序列,将这些DNA序列拼到一路。得到完备的病毒序列后,用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为有感染性的病毒RNA。

随后,钻研团队将该RNA用电穿孔技巧导入到VeroE6(猴肾细胞)中,使得细胞被感染并发出荧光。培养这些细胞的上清液(含开释出的病毒颗粒)注入到其余培养基中,可以感染其余细胞。

(用于克隆rSARS-CoV-2、rSARS-CoV-2-GFP和synSARS-CoV-2-GFP的SARS-CoV-2基因组组织和DNA片段的示意图。)

(图:从酵母克隆1.1、2.2和3.1中提取rSARS-CoV-2,从酵母克隆4.1、5.2和6.2中提取rSARS-CoV2-GFP。)

转化偶联重组技巧 (TAR)是一种十分成熟的大年夜片段DNA克隆技巧,近年来广泛利用。它是基于含同源序列的DNA片段的自由末尾在酵母细胞内能够高效同源重组的道理而建立。该技巧可从繁杂基因组中选择性分离目标DNA,且操作简便,实验周期短。

20世纪80年代,科学家首次证着实酵母细胞内两个含同源序列的DNA分子可以同源重组,并将其开拓用于更普遍的DNA体内连接或拼接,后被命名为TAR克隆技巧。

除了新冠病毒以外,钻研团队还给出了对其他34种RNA病毒全合成的技巧细节。

钻研职员表示,基于这个平台,能够在收到合成的DNA片段后的一周内,对近来盛行的SARS-CoV-2病毒设计进行化学合成克隆,并使其回生。这一历程无需从病人样本中提取完备病毒。

在熏染病迅速分布开来的环境下,在一周之内大年夜量人工临盆出有活性的病毒,将有利于科学界对新呈现的病毒做出快速反映,在暴发时代实时地天生和描述进化的RNA病毒变种的功能,为钻研扫清障碍,同时也能依据需求改造出实验所需的病毒对象。

参考资料:

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2294-9

http://news.bioon.com/article/6746553.html

http://tech.sina.com.cn/o/2002-07-13/125845.shtml

https://max.book118.com/html/2018/0731/6222140155001210.shtm

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